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2023年7月 第38卷 第7期11
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双模态全视场光学相干层析技术的角膜缘高分辨率成像

High-resolution imaging of limbus tissue with dual-mode full-field optical coherence tomography

来源期刊： 眼科学报 | 2024年4月 第39卷 第4期： 169-179 发布时间： 收稿时间：2024/7/22 13:03:58 阅读量：781
作者：
费可意#,
黄远聪#,
陈钰培,
骆仲舟,
李赛群,
袁进,
肖鹏,
关键词：
光学相干层析技术高分辨率角膜缘成像
optical coherence tomography high-resolution limbal imaging
DOI：
10.12419/24040102.
收稿时间：
2024-02-28 
修订日期：
2024-03-15 
接收日期：
2024-04-05 
目的：开发细胞级高分辨率、结构与功能一体化的双模态全视场光学相干层析系统(full-field optical coherence tomography,FFOCT)，实现角膜缘组织的双模态FFOCT成像。方法：基于Linnik干涉成像原理，利用高数值孔径显微物镜(NA=0.8)及高速平面互补金属氧化物半导体(complementary metal oxide semiconductor,CMOS)相机，设计搭建高分辨率的组织静态结构和内源动态功能成像一体化双模态FFOCT系统；构建基于四相位调制结构影像提取及时域干涉信号动态频谱分析的功能影像重建算法；对人供体角膜缘组织开展各深度层的双模式FFOCT成像有效性验证。结果：搭建的双模态FFOCT成像系统可实现横向分辨率0.5 μ m，轴向分辨率1.7 μ m，成像视野320 μ m×320 μ m，相机采集速度100 Hz。系统实现角膜缘组织无外源标记情况下的细胞级分辨率三维结构和内源功能成像，FFOCT静态结构影像清晰显示角膜缘上皮、Vogt栅栏、隐窝、基质、血管及淋巴管等结构，FFOCT动态功能影像突出显示了代谢活跃细胞(角膜缘上皮细胞、免疫细胞等)。结论：双模态FFOCT高分辨率成像系统可提供角膜缘微观结构和活细胞无标记内源功能可视化信息，将为角膜缘疾病的研究及临床诊疗提供全新的成像分析技术。
Objective: To develop a cellular-level, high-resolution, integrated dual-modal full-field optical coherence tomography (FFOCT) system capable of simultaneously imaging the structure and function of limbus tissue. Methods: Utilizing the Linnik interference imaging principle, a high-resolution dual-modal FFOCT system was designed and constructed using a high numerical aperture (NA=0.8) microscope objective and a high-speed flat CMOS camera. A functional imaging reconstruction algorithm based on four-phase modulation structure image extraction and dynamic frequency spectrum analysis of temporal interference signals was developed. The effectiveness of dual-mode FFOCT imaging at various depth layers of human corneal limbal tissue was validated. Results: The constructed dual-modal FFOCT imaging system achieved lateral resolution of 0.5 μ m, axial resolution of 1.7 μ m, imaging field of view of 320 μ m × 320 μ m, and camera acquisition speed of 100 Hz. The system enabled cellular-level resolution three-dimensional structural and intrinsic functional imaging of corneal limbal tissue without exogenous labeling. Static structural FFOCT images clearly displayed limbal epithelium, palisades of Vogt, crypts, stroma, blood vessels, and lymphatic vessels, while dynamic functional FFOCT images highlighted metabolically active cells (limbal epithelial cells, immune cells, etc.). Conclusion: The dual-modal FFOCT high-resolution imaging system provides visualization of corneal limbal microstructural and live cell intrinsic functional information without labeling, offering a novel imaging analysis technique for research and clinical diagnosis and treatment of limbal diseases.

文章亮点

1. 关键发现

成功开发了高分辨率结构与功能一体化双模态全视场光学相干层析系统 (FFOCT)，实现了人角膜缘细胞结构与功能的无标记的影像评价。

2. 已知与发现

静态结构成像展现微观结构：FFOCT 静态结构影像清晰显示了角膜缘上皮、Vogt 栅栏、隐窝、基质、血管及淋巴管等微观结构，为角膜缘组织的细胞级解剖提供了可视化信息。
动态功能成像揭示细胞活性：FFOCT 动态功能影像突出显示了代谢活跃细胞，如角膜缘上皮细胞和免疫细胞，为了解角膜缘组织的生理状态和代谢活性提供了重要线索。

3. 意义与改变

高分辨率双模态 FFOCT 成像系统提供了角膜缘微观结构和活细胞无标记内源功能可视化信息，为角膜缘相关疾病的研究和临床诊疗提供了全新的影像技术。

       角膜缘是一个微小而复杂的结构，位于角膜与巩膜之间的1.5~2.0 mm过渡区域[1]。角膜缘的完整性是保持角膜清晰、无血管的重要决定因素[2-3]。角膜缘组织包括角膜缘上皮、基质、血管、淋巴管、放射状突起等结构，与角膜不同，它没有前弹力层，后弹力层变为梳状韧带。角膜缘的基底上皮含有一种独特的成体干细胞群，称为角膜缘干细胞/祖细胞(limbal epithelial stem cells,LSCs)。LSCs具有高细胞分裂能力和向始细胞分化趋势，维持角膜上皮稳态、透明及其持续更新。LSCs及其生态位微环境损害将影响其正常增殖、迁移、分化，导致角膜上皮缺陷及结膜化，致使角膜混浊、疼痛、患者视力下降，严重者可导致失明影响生活质量，称为角膜缘干细胞缺乏症(limbal stem cell deficiency,LSCD)[4]。角膜缘细胞尤其是LSCs的数量、结构及其功能决定着各种角膜疾病，如角膜炎、结膜炎、LSCD等的发生发展、严重程度、临床表现及其诊疗策略。在角膜缘疾病的诊疗中，明确的角膜缘组织结构和功能病理变化证据是精准诊断的前提与基础，而在角膜缘植片或LSCs移植术治疗中LSCs的增殖潜力与分化能力等功能水平决定着术后角膜恢复程度与效果维持。因此实现角膜缘的细胞级结构与功能评价是临床与基础实验中的热点研究方向。通过深入理解和评估角膜缘细胞级别的变化和功能特征，我们能够更好地指导临床实践，推动角膜缘疾病的诊断和治疗取得更好的效果，从而提高患者的生活质量。另外，对LSCs的观察对于了解干细胞生物学特性、探索组织再生修复机制、开发新的干细胞治疗方案等方面具有重要的指导意义。
       临床上常用裂隙灯显微镜及荧光素染色方法对角膜缘的组织大体进行分析，这种方法依赖主观判断且非特异性，裂隙灯的低分辨率限制了对角膜缘结构和功能的早期监测。印迹细胞学检查被认为是LSCD诊断的“金标准”技术[5]，可直接检测上皮组织学变化，但该检查本身有创，且取样质量直接影响检测结果。新型眼科无创影像技术为角膜缘的影像评估提供更便捷、稳定、丰富的客观信息。如在体激光扫描共聚焦显微镜(in vivo confocal microscopy,IVCM)可获取眼表细胞结构平面图像[6]，前段光学相干层析成像(anterior segment optical coherence tomography,AS-OCT)可对角膜缘分层结构进行横断面成像[7]，光学相干层析血管造影(optical coherence tomography angiography,OCTA)可实现角膜缘血管系统的可视化[8]。然而现有的影像评价手段都有着各自的局限性：IVCM是接触性成像方式，且影像信息不具有特异性，而无法提供细胞的直接信息；AS-OCT为非接触式成像，但无法实现细胞级水平的结构成像，OCTA所提供的信息单一且无法量化评价。眼科临床尚无针对角膜缘无创、细胞级分辨率的三维结构功能成像技术及敏感有效的影像评价指标。研发新型角膜缘成像平台，建立角膜缘结构及功能影像客观评价方法，将为眼表疾病的诊疗全过程提供重要影像信息。
       全视场光学相干断层扫描(full- field optical coherence tomography,FFOCT)是基于空间非相干光平面干涉的高三维分辨率成像(空间分辨率1 µ m)技术[9]。FFOCT结合了传统OCT非接触成像、大成像视野以及共聚焦显微镜高分辨率特点，可实现生物组织细胞结构影像获取[10-11]。近年来FFOCT已被应用于眼科成像，实现了对角膜及角膜缘等组织的细胞结构、神经纤维形态及血管分布的大成像视野高分辨率结构成像[12-13]。通过使用FFOCT对离体组织进行成像，采集成像信号随时间推移的干涉信号集，并对这一信号进行处理，可以获得基于时空信号生成与FFOCT图像互补的亚细胞对比度，这一技术称为动态全视场相干断层扫描技术(dynamic FFOCT,D-FFOCT)[14]。D-FFOCT实现了可视化亚细胞代谢活动的功能信息含义，前期实验[15-17]已经证明，D-FFOCT可用于区分细胞不同状态(如正常、垂死或死细胞)，并且不同的细胞类型在D-FFOCT图像中有不同信号表现，与细胞内的细胞器运动密切相关。目前尚未有研究将D-FFOCT应用于角膜缘细胞功能的探索。双模态FFOCT技术的引入展现出独特的优势。相较于传统的OCT[18]，双模态FFOCT不仅实现了高横向分辨率的平面(en face)细胞结构图像，同时获取了结构和功能信息。IVCM[19-20]可实现微米级别的平面分辨率，但其扫描速率较低，双模态FFOCT具有更高的轴向分辨率，提供详尽的深度信息。不同于荧光显微镜[21-22]，FFOCT无需对样本进行固定或染色，也无需引入外源性标记，避免了光漂白与光毒性的问题，为一种无创、非侵入式成像方式。
       本研究设计了一种双模态FFOCT系统用于静态和动态细胞成像，并对供体角膜缘样本进行了成像探索。其旨在通过细胞水平的双模态FFOCT图像阐明角膜缘组织的结构特征与细胞功能信号表现，特别是揭示角膜缘上皮细胞的动态信号。研究结果表明，静态FFOCT图像有效地描绘了角膜缘结构，如POV、LC、血管壁等，动态FFOCT图像在强调代谢活性变化引起的细胞内源性对比度方面发挥了重要作用。动态影像信息突出了关于角膜缘上皮中不同类型细胞、基质中免疫细胞的特定功能信息，而无需造影剂标记。

1 资料与方法

       本研究在中山大学中山眼科中心进行，研究遵循赫尔辛基宣言。经中山眼科中心机构审查委员会批准(2022KYPJ138)。研究前将研究目的告知受试者，并获得所有受试者的同意。

1.1 样本来源

       所有供体角膜缘样本为在中山眼科中心实施角膜移植术后被环钻切取中央角膜后剩余的供体角巩膜环。所有供体角膜来源于广东省眼库，且均符合中国眼库协会规定的标准操作规程并实际应用于临床角膜移植术。供体角膜在采集后24 h内被转移到特定的无菌环境中进行处理。处理过程中，所有样本都在4 °C的条件下保存，并使用含有抗生素的保存液进行保存，以防止任何可能的微生物污染。样本运输过程中，保证在恒温箱中，温度控制在2~8°C，以保持样本的活性和完整性。术后废弃的供体角巩膜环仍然保留着2~5 mm的周边角膜组织和完整的角膜缘组织。所有样本储存于Optisol GS中，并在低温下保存运输，以保证组织样本的活性。本实验基于10例样本进行研究。

1.2 方法

       1.2.1 双模式FFOCT成像系统的光学设计
      FFOCT的基本原理参考文献[23]。双模式FFOCT成像系统设置示意图如图1A所示，我们所搭建的双模态FFOCT系统由具有空间不相干LED照明的Linnik干涉测量法组成，其中心波长为660 n m(M660L3,Thorlabs)。通过50∶50立方分束器(Beamsplitter,BS)将照明光分割并引导到样品和参考臂中的两个相同的高数值孔径(Numerical Aperture,NA=0.8)水浸显微镜物镜(NIR APO40 ×0.8 NA,Nikon)中。系统样本臂中从样本不同深度向后散射的光信号和参考臂中反射镜反射的光信号由立体分光器重新组合通过相机聚焦透镜最后由大满阱容的CMOS相机(Q-2A750-Hm/CXP-6,Adimec)检测成像。NA=0.8显微镜在理论上达到了0.5 μ m的横向分辨率(根据瑞利标准)。由于物镜的焦距仅为1.7 μ m，远小于LED光源的相干长度(7.7 μ m)，因此轴向分辨率为1.7 μ m。系统视场大小为320 μ m×320 μ m，系统性能使用分辨率板进行成像验证，如图1B所示。

图1 双模态FFOCT成像系统的光路设计与性能验证
Figure 1 Optical path design and performance verification of dual-mode FFOCT imaging system
(A)双模态FFOCT成像系统光路设计图；(B)分辨率板成像验证。标尺：50 μ m。
(A) Optical path design of dual-modal FFOCT imaging system; (B) Resolution plate imaging verification. Scale bar: 50 μ m.

       1.2.2 FFOCT的静态与动态模式图像处理
      在静态FFOCT模式中，利用压电换能器(piezoelectric transducer,PZT)支撑的参考镜，通过光学路径长度调提取全场干涉振幅。本研究采用四相位调制方案，利用位于参考臂反射镜后PZT对参考臂光程引入相位差等于π/4的光程步进调制，CMOS相机同步采集原始图像，其中I1~I4使用公式(1)计算：

       式中，I0是照明的光子通量，Rinc是来自所有样本结构和光学系统部件的非相干反射率，Rcoh-sample (x, y)是来自位于相干体积内的所有样本结构的相干反射率；Rref是来自参考镜的反射率，是样本和参考信号之间的相位差(表示2D图像中的条纹)。
       对4个图像进行如公式(2)的计算，获得单张FFOCT的平面(en face)图像。为了提高图像质量，在同一成像深度采集处理多张平面图像，并对图像进行平均处理以获得更好的最终FFOCT结构图像。CMOS相机工作频率为100 Hz，最终结果FFOCT图像采集速度为25帧/秒。
       对于动态FFOCT模式，参考臂中的PZT无相位调制，在每个成像位置记录两个臂的时间序列干涉图(通常在100 Hz频率下的500幅图像)的后向散射信号：
式中，I是相机上接收到的强度，I0来自参考信号和相干门内外的固定后向散射光，α 是振幅，Φ 是干扰基准的后向散射信号的相位，t 为给定的持续时间，(x, y, z)为位置坐标轴。其中包含生物样品本身内部的自然动力学引起的信号变化。获取一个(1 440×1 440，512)张量，其中1 440×1 440是传感器像素的数量，512是记录帧的数量。动态图像数据采集完成后分析图像堆栈中每个体素的功率谱，并对原始信号执行奇异值分解和自适应阈值滤波以消除动态伪影。将傅里叶变换应用于这些三维数据，然后通过三个不同的通道来计算不同的物理参数，从而获得三维彩色图像，计算方法参考既往研究[24]。平均频率记录在色调通道中，其中红色通道对应于低频(0~<0.6 Hz)，绿色通道对应于中频(0.6~<5.4 Hz)，蓝色通道对应于高频(5.4~25 Hz)。饱和通道代表每个体素的频率带宽的倒数值。值通道由50个图像的移动窗口的标准差组成，表现为细胞内运动的最终强度。
       最终双模态FFOCT系统可实现横向分辨率为0.5 μ m，纵向分辨率为1.7 μ m，成像视野为320 μ m×320 μ m。在所选区域的每个样品上采集320 μ m×320 μ m平面图像，通过轴向平移生物样本，可以在不同的样本深度采集静态和动态FFOCT图像，并应用散焦校正算法来匹配相干平面和物镜焦平面[25-26]。在整个角膜深度上以1 μ m的步长采集光学切片，从而形成3D数据堆栈，该堆栈可以在自定义查看软件中作为平面静止帧或动图、作为重建的静止帧或动图横截面或在3D体积渲染中查看。对于采集320 μ m×320 μ m×250 μ m堆叠用时不到5 min。

2 结 果

       本研究所搭建的双模态FFCOT系统可对非透明的角膜缘组织实现高分辨率、非标记、结构与功能一体化成像，静态FFOCT提供基于样品折射率梯度的静态结构信息，D-FFOCT利用细胞内代谢活动产生的固有图像对比度。

2.1 角膜缘组织的静态结构影像

       在结构影像中，角膜缘的结构特征清晰可见。外周角膜与角膜缘过渡区(图2A)的上皮中可见细胞呈现高反射性清晰的细胞边界和低反射的胞质且细胞核不可见(图2A黄框)，部分细胞表现为细胞边界不清和高反射的胞质(图2A蓝框)。在角膜缘和外周角膜的界面处观察到由高反射细胞围绕成圈的局灶性基质投影(focal stromal projections,FSPs)(图2A，红色箭头)，圆圈内呈相对低反射率。FSPs是角膜缘基质向包含中央血管的角膜缘上皮的指状突起[27]。在其深处的角膜缘基底细胞层可见血管的走行(图2B，红色箭头)。在靠近巩膜端的角膜缘上皮中包含高反射线性结构的纤维血管嵴(图2C，红色箭头)，称为Vogt栅栏(palisades of Vogt,POV)，角膜缘隐窝(limbus crypts,LC)在POV之间延伸为放射状矩形或圆形，如图2C所示。在LC的外缘可见高反射、体积小且形状不规则的细胞(图2C，黄色箭头)，这很可能对应于位于POV和LC之间界面的黑色素细胞簇。与分布在LC中央部分的细胞(图2C，蓝色箭头)相比，在靠近边缘隐窝壁的地方可观察到较小的低反射细胞(图2C，绿色箭头)。在色素沉着的角膜缘中可见圆形或椭圆形POV相互连接(如图2D所示)，LC外缘为更明显的高反射黑色素细胞簇，在POV褶皱下方沿POV径向延伸的低反射线性形态特征对应于毛细血管或外周角膜神经(图2D，红色箭头)。图2E中的图像对应于POV底部和下方巩膜组织界面的深度位置，POV和CL反射率随着深度发生改变，在基质中CL区域为超反射，并与浅层POV对应的较暗区域交替出现(平均深度为105 μ m)。对角膜缘结构进行三维重建，如图2F所示，高反射细胞集中在角膜缘基底层，在角膜缘区域中分布不均匀。图2G展示了POV和LC的横截面，LC的细胞结构可见，为高反射的边缘细胞包绕着中央低反射的细胞。
图2 人角膜缘的FFOCT结构影像
Figure 2 FFOCT structural imaging of human limbus
(A)外周角膜与角膜缘过渡区的上皮；(B)靠近角膜端的角膜缘基底上皮；(C)角膜缘隐窝与Vogt栅栏；(D)色素沉着的角膜缘隐窝与Vogt栅栏；(E)POV底部和下方巩膜组织界面；(F)角膜缘结构的三维重建；(G)角膜缘隐窝与Vogt栅栏的横截面。
FFOCT成像视野：320 μ m×320 μ m. 标尺：50 μ m.
(A) Epithelium at the transition zone between peripheral cornea and limbus; (B) Limbal basal epithelium near the cornea; (C) LC and POV; (D) Pigmented LC and POV; (E) The interface between POV and scleral tissue; (F) 3D reconstruction of limbal structure; (G) Cross-section of LC and POV.
FFOCT imaging field: 320 μ m × 320 μ m. Scale bar: 50 μ m.

2.2 角膜缘组织的结构与功能双模态影像

       图3展示了浅色素角膜缘从浅到深的双模态FFOCT影像，角膜缘浅层上皮在静态图像表现出高反射性细胞边界和细胞内低反射性(图3A)，在动态图像中表现为细胞内均匀的功能信号(图3B)，同一层上皮细胞的功能信号表现为频率差异小，但细胞间的信号强度存在差异，这可能是由于细胞位于不同层导致的，部分细胞保留结构轮廓但失去功能信号，这可能是样本保存过程中细胞失去活性。动态影像可以突出每一层真实具有功能活性的上皮细胞。在角膜缘上皮更深层的POV和LC结构中(图3C)，线性高反射的纤维血管嵴在其对应的动态图像(图3D)无功能信号。在角膜缘基底上皮层结构图像中(图3E)，高反射的小细胞轮廓不清，尤其靠近POV边缘的小细胞簇，在动态图像(图3F)中这些有着功能活性细胞的边界、轮廓可以被清晰地分辨出来。因此动态图像更适用于对角膜缘细胞进行量化分析，如在角膜缘浅层上皮细胞密度为(4 652±1 587)/mm²，基底层细胞密度为(7 630±2 347)/mm²，POV边缘的小细胞簇直径约为2.2~9.5 μ m。角膜缘基质的静态图像(图3G)中可见高反射的管壁与低反射的管腔，管腔内存在类圆形的暗细胞，细胞轮廓不清难分辨，管径为6.2~32.8 μ m。在其对应的动态图像中(图3H)基质纤维、管壁无功能信号，管腔内的细胞表现为胞质内活跃的功能信号和细胞核低信号，直径为4.5~14.2 μ m，根据细胞和细胞核的形态、直径可判断管腔内细胞为免疫细胞，这些管腔为淋巴管。对角膜缘上皮的双模态FFOCT图像进行三维堆叠(图3I、J)，可见高反射细胞主要分布在基底层，动态影像三维展现了上皮细胞的功能信号分布。
图3 浅色素角膜缘的深度双模态FFOCT影像
Figure 3 Depth dual-mode FFOCT imaging of light pigmented limbus
(A、B)角膜缘浅层上皮的静态和动态图像；(C、D)角膜缘POV和CL的静态和动态图像；(E、F)角膜缘基底层的静态和动态图像；(G、H)角膜缘基质的静态图像和动态图像；(I、J)角膜缘上皮三维重建的静态图像和动态图像。标尺：50 μ m。
(A, B) Static and dynamic images of superficial epithelium at the limbus; (C, D) Static and dynamic images of POV and CL at the limbus; (E, F) Static and dynamic images of basal layer at the limbus; (G, H) Static and dynamic images of limbal stroma; (I, J) Static and dynamic images of three-dimensional reconstruction of limbal epithelium. Scale bar: 50 μ m.

       在色素沉着角膜缘的浅层上皮中大部分细胞呈低反射，也可见少量低反射细胞体内存在大小不等的高反射点块(图4A)，其动态图像中功能信号无明显差异，细胞体为均匀一致的信号强弱(图4B)。在中层的上皮中，带有高反射点块的细胞增多，且部分细为全高亮(图4C)，细胞之间的功能信号表现可能存在细微差异(图4D)。动态图像可区别高反射率结构区域中单个的细胞。在更深层的上皮中，细胞变小、密度增加，细胞直径为3.2~8.5 μ m，密度为(8 454±2 818)/mm²，高反射细胞散在分布于整个细胞层中(图4E)。在动态图像中细胞间功能信号有差异，高信号细胞可围成圆圈、放射状等形状并包绕着低信号细胞(图4F)。在基底上皮层中，大量高反射细胞聚集，而低反射细胞散在分布且难分辨(图4G)。在其对应的动态图像中高反射细胞可表现为高信号、低信号、无信号，这说明细胞功能信号表现与结构反射率表现不存在联系(图4H)。

图4 色素沉着角膜缘上皮的深度双模态FFOCT影像
Figure 4 Depth dual-mode FFOCT imaging of hyperpigmented limbal epithelium
(A、B)角膜缘浅层上皮的静态和动态图像；(C、D)角膜缘中层上皮的静态和动态图像；(E、F)角膜缘深层上皮的静态和动态图像；(G、H)角膜缘基底层上皮的静态和动态图像。标尺：50 μ m。
(A, B) Static and dynamic images of superficial epithelium at the limbus; (C, D) Static and dynamic images of mid-level epithelium at the limbus; (E, F) Static and dynamic images of deep epithelium at the limbus; (G, H) Static and dynamic images of basal epithelium at the limbus. Scale bar: 50 μ m.

2.3 角膜缘上皮细胞的不同双模态影像表现

       角膜缘上皮细胞中的可存在不同影像表现，如图5A红框(放大图为图5C)中细胞大小不规则、边界不清楚，而其动态图像图5B红框(放大图为图5D)中无功能信号的表现，这可能代表着部分失活细胞。上皮中静态影像呈低反射、边界明亮清晰结构的细胞(放大图为图5E)，在动态影像中表现为细胞内均匀功能信号。静态图像中团状高反射小细胞簇(放大图为图5G)在动态图像中表现为单个小功能信号团的聚集(放大图为图5H)。在角膜缘基底层隐窝结构中可见高反射、低反射、细胞边界不清等多种影像表现的细胞，而LC是角膜缘干细胞的生态位结构，因此隐窝中的多种细胞可能干细胞的支持细胞。低反射、轮廓不清的小块状结构(放大图为图5K)在动态影像中表现为高功能活性的颗粒状信号(放大图为图5L)。具有清晰边界的高反射细胞(放大图为图5M)在动态图像中显示出均匀的高频信号(放大图为图5N)。边界高亮的低反射细胞(放大图为图5O)在动态图像中表现出均匀的高频信号(放大图为图5P)，但其功能信号表现与图5N中的信号有着频率、强度的差异。

图5 角膜缘上皮细胞双模态FFOCT成像的不同影像表现
Figure 5 Different imaging manifestations of limbal epithelial cells with dual-mode FFOCT
(A、B)角膜缘浅层上皮的静态和动态图像；(C-H)浅层上皮不同细胞类型的影像表现；(I、J)角膜缘基底层上皮的静态和动态图像；(K-P)基底层上皮不同细胞类型的影像表现。标尺：50 μ m。
(A, B) Static and dynamic images of superficial epithelium at the limbus; (C-H) Imaging manifestations of different cell types in the superficial epithelium; (I, J) Static and dynamic images of basal epithelium at the limbus; (K-P) Imaging manifestations of different cell types in the basal epithelium. Scale bar: 50 μ m.

3 讨论

       本研究首次采用双模式FFOCT对角膜缘进行成像，证明了其在角膜缘组织中高分辨率结构成像和功能成像方面的互补潜力和动态对比度。对角膜缘结构与功能的研究尤其是角膜缘干细胞的研究一直是迫在眉睫的眼科重要课题。例如角膜缘移植材料中LSCs的鉴定和表征，以及移植前的功能质量检测，对于确保术后角膜表面的成功重建至关重要[28]。在既往研究中，角膜印迹法、角膜细胞采集和培养、流式细胞术、免疫组化、PCR分析、电子显微镜可用于了解角膜缘干细胞的特性和功能[29-33]，但这些技术需要对细胞做出额外的修饰或染色而非无创方法，且取样质量
直接影响检测结果。随着影像技术的发展与革新，无创、客观、精度高、重复性好的影像技术成为眼科诊疗过程中的重要辅助工具。
       AS-OCT可以获得包括角膜缘在内的眼前节横截面图像，测量角膜上皮厚度作为LSCD的诊断参数[34]。IVCM可以在细胞水平上可视化角膜缘的微观结构，从而描述病理结构改变[35]。本研究中证明了双模态FFOCT技术可以捕获角膜缘组织的细胞水平结构和动态功能成像，高分辨率3D图像有助于观察角膜缘的细胞分布。POV和LC在不同深度的平面图像中可发现细胞、纤维、血管之间的图像反射率和功能信号存在差异，SD-OCT影像也证实了这一点[36]，不同影像表现的可能代表角膜缘中多种类型的细胞。角膜缘基底层内可见大量明亮、小而不规则的基底上皮细胞，具有活跃的细胞内功能信号。我们推断结构影像中的高反射是由角膜缘色素导致的，这与IVCM对色素沉着角膜缘成像表现是一致的[37]，深色素角膜缘高反射细胞明显多于浅色素角膜缘。
       既往研究中有学者提出细胞的形态学评估以及定位可以简单地将LSCs和成熟的角膜上皮进行区分，角膜缘干细胞和早期瞬时扩增细胞的尺寸明显较小(直径≤12 μ m)而圆，具有典型的“鹅卵石”形态，核质比相对较大，并且倾向于集中在LC边缘，而角膜缘上皮细胞的尺寸较大，并且占据了LC的大部分[38-39]。本实验中，我们也发现了类似的影像特征，尤其是LC结构中的多种细胞表现，但这些细胞的内源性高频信号暂无法证明是否上皮细胞低分化和高增殖能力的特征，这是因为实验中的样本处于稳态环境，并且检测时间较短。在后续的研究中我们可以使用双模态
FFOCT对由LSCs在体外培养获得的类器官进行观察，监测角膜缘干细胞的活性和动态过程，如细胞迁移和分化。然而实现样本的长时间序列的观察和分析还需要解决一系列挑战，包括如何有效处理和保持样本的生物活性和完整性、优化双模态FFOCT成像参数以适应动态变化的细胞光学特性以及如何从庞大的数据进行处理并提取出有意义的生物信息。我们期待利用双模态FFOCT来实现实时监测和动态观察角膜缘干细胞在体外培养过程中的生物学行为，评估其在再生医学中的潜在治疗效果，并优化体外培养条件以促进干细胞的增殖分化和功能表达。
       传统FFOCT采用单一的成像模式，操作相对简单，成像速度也较快，适用于样本的快速诊断。然而，其仅能提供结构数据，限制了在多维度研究中的应用。相比之下，双模态FFOCT结合了两种成像模式，能够同时获取结构和功能信息，但由于需要采集多种数据，成像时间相对较长，并且对样本的活性要求较高。样本的光学性质对成像质量和深度也有重要影响。此外，双模态FFOCT所产生的数据更为复杂，因此处理和分析的难度相应增加。现阶段双模态FFOCT在活体成像中的应用存在一定的局限性，体内成像引入了多种干扰因素，例如眼球运动引起的运动伪影、微弱的内源性动态变化信号被掩盖，以及光学像差引起的图像质量变化。
       在未来，我们将致力于改进双模态FFOCT技术的光学系统，优化数据处理算法，并制定统一的影像处理标准，以克服目前面临的挑战。本研究实现了离体角膜缘组织的结构与功能一体化成像并提供了有价值的信息，但这些结果无法完全模拟生物体内复杂的环境和生理过程。我们仍需进一步研究和验证，以确定它们在生物体内的实际应用潜力。总之，双模态FFOCT提供了关于角膜缘微观结构特征和细胞功能活性的多维信息，这对于研究LECs在角膜维持和修复中的作用至关重要。因此，双模态FFOCT技术有望成为角膜缘细胞级结构及功能影像客观评价新方法。

利益冲突

   所有作者均声明不存在利益冲突。

致谢

   感谢王柏文博士和彭露露博士在供体角膜缘样本收集方面的协助，李嘉雄工程师和马可工程师在图像处理方面的指导，以及邓宇晴博士在角膜缘图像解释方面的有益建议。

开放获取声明

    本文适用于知识共享许可协议 ( Creative Commons)，允许第三方用户按照署名(BY)-非商业性使用(NC)-禁止演绎(ND)(CC BY-NC-ND)的方式共享，即允许第三方对本刊发表的文章进行复制、发行、展览、表演、放映、广播或通过信息网络向公众传播，但在这些过程中必须保留作者署名、仅限于非商业性目的、不得进行演绎创作。详情请访问：https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/。

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1、 国家自然科学基金(82271133，82230033)；广东省科学技术厅(2021TQ06Y137， 2021TX06Y127)；广东省基础与应用基础研究基金(2022A1515011486)；眼科学国家重点实验室基础研究基金。
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (82271133, 82230033), the Department of Science and Technology of Guangdong Province (2021TQ06Y137, 2021TX06Y127), the Basic and Applied Basic Research Foundation of Guangdong Province (2022A1515011486) and the Fundamental Research Funds of the State Key Laboratory of Ophthalmology.()
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一亿年进化出的晶状体有多重要？

How important is the lens evolved in 100 million years?

发布于: 2022-12-01
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