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2023年7月 第38卷 第7期11
目录

高效液相色谱法同时测定盐酸丁卡因滴眼液中盐酸丁卡因和羟苯乙酯的含量

Determination of tetracaine hydrochloride and ethyl hydrobenzoate in tetracaine hydrochloride eye drops by HPLC

来源期刊： 眼科学报 | 2022年4月 第37卷 第4期： 291-297 发布时间： 收稿时间：2023/1/13 10:15:52 阅读量：3360
作者：
李裕军,
陈婕婷,
胡缨贤,
马淑媚,
王延东,
关键词：
高效液相色谱法同时测定盐酸丁卡因羟苯乙酯含量测定
high-performance liquid chromatography simultaneous determination tetracaine hydrochloride ethyl hydrobenzoate quantitative analysis
DOI：
10.3978/j.issn.1000-4432.2022.02.05
收稿时间：
 
修订日期：
 
接收日期：
 
目的：建立高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)测定盐酸丁卡因滴眼液中盐酸丁卡因和羟苯乙酯的含量。方法：采用Agilent Eclipse PLUS C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；以1%三乙胺溶液(三乙胺10 mL，加水990 mL，用冰醋酸调节pH值至5.0±0.5)-乙腈(65 : 35)为流动相，流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为256 nm；进样体积20 μL。结果：盐酸丁卡因在0.05~0.36 mg/mL范围内线性关系良好( r =1.000)，平均回收率为99.2%，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为0.3%(n=9)，羟苯乙酯在3.02~24.14 μg/mL范围内线性关系良好(r=1.000)，平均回收率为98.2%，RSD为0.4%(n=9)，该方法重现性好。对照品溶液和供试品溶液在室温放置24 h基本稳定；结论：本方法简便、快速、准确。适用于检测盐酸丁卡因滴眼液中盐酸丁卡因和羟苯乙酯的含量。
Objective: To establish a high-performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of tetracaine hydrochloride and ethyl hydrobenzoate in tetracaine hydrochloride eye drops. Methods: The analytic column was Agilent Eclipse Plus C18 (4.6 mm ×250 mm, 5 μm) and the mobile phase was 1% triethylamine solution (10 mL triethylamine and 990 mL water, pH adjusted to 5.0±0.5 with glacial acetic acid) - acetonitrile (65:35) at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 256 nm and the column temperature was 30 ℃. The injection volume was 20 μL. Results: The linear range of tetracaine hydrochloride was well shown within 0.05–0.36 mg/mL (r=1.000). The average recovery rate of tetracaine hydrochloride was 99.2% with relative standard deviation (RSD) 0.3% (n=9). The linear range of ethyl hydrobenzoate was well shown within 3.02–24.14 μg/mL (r=1.000). The average recovery rate of tetracaine hydrochloride was 98.2% with RSD 0.4%(n=9). The method had high reproducibility. The reference solution and testing solution were stable for 24 h in room. Conclusion: The method is simple, quick and accurate, which is suitable for the determination of tetracaine hydrochloride and ethyl hydrobenzoate in tetracaine hydrochloride eye drops.
    电光性眼炎是角膜上皮细胞和结膜吸收大量而强烈的紫外线所引起的急性无菌性炎症，是临床上最常见的辐射性眼病之一。在临床治疗上先用盐酸丁卡因滴眼液等表面麻醉剂解除眼睑痉挛并进行下一步治疗[1-3]。
    盐酸丁卡因滴眼液是临床上常用的局部麻醉剂，其主要成分为盐酸丁卡因、氯化钠和羟苯乙酯等。常用的羟苯乙酯含量测定方法为紫外分光光度法，盐酸丁卡因的含量测定方法通常为永停滴定法、紫外-可见分光光度法等[4-6]。相对比上述方法，高效液相色谱法(high-performance liquid chromatography，HPLC)更加准确高效。因此，笔者开发了一种高效液相色谱法同时测定盐酸丁卡因滴眼液中盐酸丁卡因和羟苯乙酯的含量，为盐酸丁卡因滴眼液的质量检验和控制提供了更简便、更精确、更高效的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

    高效液相色谱仪(Agilent 1100，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器等)；BT-125D型电子天平(德国Sartorius公司)。

1.2 试药

    羟苯乙酯对照品(中国食品药品检定研究院，批号100847-201604，含量99.9%)，盐酸丁卡因对照品(中国食品药品检定研究院，批号100456-201602，含量100.0%)，盐酸丁卡因滴眼液(规格10 mL:50 mg，批号161128、161129、161130，中山大学中山眼科中心制剂室)，乙腈为色谱纯，三乙胺和冰醋酸为分析纯，水为注射用水。

1.3 色谱条件

    采用 Agilent Eclipse PLUS-C18 色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以1%三乙胺溶液(三乙胺10 mL，加水990 mL，用冰醋酸调节pH值至5.0±0.5)-乙腈(65:35，V/V)为流动相，流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为256 nm；进样体积20 μL。

1.4 溶液的制备

    1.4.1 盐酸丁卡因对照品储备液
    精密称取盐酸丁卡因对照品25.79 mg置于10 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。
    1.4.2 羟苯乙酯对照品储备液
    精密称取羟苯乙酯对照品15.12 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加适量热水溶解，用水稀释至刻度，摇匀。
    1.4.3 混合对照品溶液
    精密量取盐酸丁卡因对照品储备液和羟苯乙酯对照品储备液各1 mL，置于10 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.258 mg/mL的盐酸丁卡因溶液和0.015 mg/mL的羟苯乙酯溶液。
    1.4.4 供试品溶液
    精密量取供试品5mL，置于100 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
    1.4.5 阴性样品溶液
    精密量取缺盐酸丁卡因和羟苯乙酯的阴性样品5 mL，置于100 mL容量瓶中，用稀释液稀释至刻度，摇匀。

1.5 方法学验证

    1.5.1 专属性试验
    取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液进样，记录色谱图。
    1.5.2 线性与范围
    精密称取盐酸丁卡因对照品和羟苯乙酯对照品适量，用水溶解并稀释制成浓度为含盐酸丁卡因2.579 mg/mL和羟苯乙酯0.150 mg/mL的混合对照品储备液，精密量取混合对照品储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.4 mL置于10 mL棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成含盐酸丁卡因0.05、0.10、0.15、0.21、0.26、0.36 mg/mL和含羟苯乙酯3.02、6.04、9.06、12.08、15.10、21.14 μg/mL的系列浓度溶液。精密量取各溶液20 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积并记录色谱图。
    1.5.3 精密度
    分别取混合对照品溶液和供试品溶液重复进样6次，测定峰面积并记录色谱图。
    1.5.4 加样回收率试验
    分别精密称取盐酸丁卡因原料适量，分别配制约为规定量80%、100%、120%的回收率测定溶液各3份，共9份，按照处方比例加入辅料，制备供试品溶液，并进样测定峰面积，计算样品中盐酸丁卡因的含量和回收率。
    分别精密称取羟苯乙酯适量，分别配制约为规定量80%、100%、120%的回收率测定溶液各3份，共9份，按照处方比例加入辅料，制备供试品溶液，并进样测定峰面积，计算样品中羟苯乙酯的含量和回收率。
    1.5.5 溶液稳定性
    分别取供试品溶液和混合对照品溶液，置室温放置，在0、2、4、8、12、24 h时进样，测定盐酸丁卡因和羟苯乙酯峰面积，计算盐酸丁卡因和羟苯乙酯含量。
    1.5.6 耐用性试验
    在试验中对柱温、流速进行适当调整，分别测定盐酸丁卡因滴眼液中盐酸丁卡因和羟苯乙酯的含量，以考察方法的耐用性。其他色谱条件不变，分别在柱温为2 5、3 0、35 ℃及流速为0.8、1.0、1.2 mL/min条件下进行实验，记录盐酸丁卡因峰和羟苯乙酯峰的保留时间并计算各色谱条件下的盐酸丁卡因和羟苯乙酯含量。
    1.5.7 样品含量测定
    取对照品溶液和供试品溶液进样，测定峰面积并记录色谱图，计算盐酸丁卡因和羟苯乙酯的含量。盐酸丁卡因的含量按外标法以峰面积计算，应为标示量的93.0%~107.0%。羟苯乙酯的含量按外标法以峰面积计算，应为标示量的80.0%~120.0%。

2 结果

2.1 专属性试验

    供试品溶液色谱图中，与对照品溶液中羟苯乙酯峰和盐酸丁卡因峰相同保留时间处，有相同的峰，且峰形对称，无相邻杂质峰。阴性样品溶液色谱图中无与盐酸丁卡因峰和羟苯乙酯峰相同保留时间的峰出现，即其他辅料无干扰(图1)。
20230113102356_8267.png
图1 高效液相色谱图
Figure 1 High performance liquid chromatography chromatograms
1：盐酸丁卡因；2：羟苯乙酯；A：混合对照品溶液；B：供试品溶液；C：阴性样品溶液。
1: tetracaine hydrochloride; 2: ethyl hydrobenzoate; A: reference substance solution; B: testing solution; C: control.

2.2线性与范围

    盐酸丁卡因线性：以盐酸丁卡因浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标制作标准曲线图，线性回归方程为A=3672.344C+12.242，r=1.000。结果表明盐酸丁卡因在0.05~0.36 mg/mL范围内，线性关系良好(表1)。
表1 盐酸丁卡因线性与范围
Table 1 Linear and range of tetracaine hydrochloride
20230113105034_5291.png

     羟苯乙酯线性：以羟苯乙酯浓度(C)为纵坐标，峰面积(A)为横坐标制作标准曲线图，线性回归方程为A=109.224C+12.596，r=1.000。结果表明羟苯乙酯在3.02~24.14 μg/mL范围内，线性关系良好(表2)。

表2 羟苯乙酯线性与范围
Table 2 Linear and range of ethyl hydroxybenzoate
20230113105347_9229.png

2.3 精密度

    取对照品溶液连续进样 6 次，以峰面积计算，结果盐酸丁卡因峰面积相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为0.2%(n =6 )。羟苯乙酯峰面积的RSD为0.1%( n =6 )，另取供试品溶液连续进样6次，以峰面积计算，盐酸丁卡因峰面积RSD为0.3%( n =6 )。羟苯乙酯的峰面积RSD为0.3%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.4 加样回收率试验

    9份供试品溶液的盐酸丁卡因的平均回收率为99.2%，RSD为0.3%(n=9)。结果如表3所示。9份供试品溶液的羟苯乙酯的平均回收率为98.2%，RSD为0.4%(n=9)。结果如表4所示。3个浓度下盐酸丁卡因和羟苯乙酯的平均回收率均为97.7%~99.6%，9个回收率数据的RSD均小于2.0%，表明含量测定方法可靠。

表3 盐酸丁卡因回收率实验结果
Table 3 Results of adding tetracaine hydrochloride recovery
20230113111054_0792.png
表4 羟苯乙酯加样回收率实验结果
Table 4 Results of adding ethyl hydrobenzoate recovery

20230113111258_7627.png

2.5 溶液稳定性

    6个时间点下盐酸丁卡因和羟苯乙酯的含量RSD为0.7%和0.6%，表明在室温条件下对照品溶液和供试品溶液24 h内稳定。

2.6 耐用性试验

    耐用性试验结果表示：柱温和流速对盐酸丁卡因和羟苯乙酯的含量测定结果影响较小，结果如表5所示。

表5 耐用性试验结果
Table 5 Results of durability test
20230113111359_8630.png

2.7 样品含量测定

    三批制剂检测结果见表4，盐酸丁卡因含量均在标示量93.0%~107.0%的范围内，羟苯乙酯含量均在标示量80.0%~120.0%的范围内，检测结果符合标准规定。结果如表6所示。

表6 三批盐酸丁卡因滴眼液的含量测定结果
Table 6 Three batches analysis results of tetracaine hydrochloride eye drops
20230113111805_0577.png

3 讨论

    盐酸丁卡因滴眼液为局部麻醉剂，根据《中国药典》二部，其质量标准含量测定方法为永停滴定法[7]。该法准确性差，误差大，测量结果较实际含量偏低，不能满足基层医院制剂快速检测的需要，同时比较紫外可见分光光度法和酸碱滴定法，高效液相色谱法测定的结果更为准确可行[8]。盐酸丁卡因滴眼液属于无菌制剂，为保证制剂不被微生物污染，因此制剂中一般都会添加适量的羟苯乙酯[9-10]。传统的羟苯乙酯含量检测方法为紫外分光光度法，该方法误差较大、稳定性差。经笔者结合盐酸丁卡因含量测定的需要，参考相关研究，开发了一种HPLC同时检测盐酸丁卡因和羟苯乙酯两种组分的含量[11-16]。
    通过方法学试验验证和3批样品的含量测定，该测定方法专属性强，准确度高，重现性好。能够准确有效地对盐酸丁卡因滴眼液中盐酸丁卡因和羟苯乙酯的含量进行检验和控制。
    相较于以往的永停滴定法、紫外分光光度法及酸碱滴定法等测定盐酸丁卡因的含量，HPLC具备更精确、更直观的结果显示，减少了人为的影响和系统误差，使得结果更准确可靠，在国家对药品生产质量管理规范不断加强的今天，更符合党和国家对药品质量要求的趋势和期望；同时相较于以往使用不同的分析方法对盐酸丁卡因和羟苯乙酯的含量进行分别测定，笔者开发的一种对该制剂中两种组分含量的测定方法[17-20]，脱离了原来繁琐的配样过程和实验准备，实现了检验的半自动化，用更少的试剂、更简捷的配样操作、更直观的结果进一步为盐酸丁卡因滴眼液的质量检验提供了更便捷、高效的方法，是广大药品检验工作者的一大福利。与此同时，该方法的实际应用也为生产企业降低了生产和检验等制药成本，减轻了百姓药品费用的负担，同时也为医生和患者安全有效地用药提供了更准确可靠的依据。

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一亿年进化出的晶状体有多重要？

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发布于: 2022-12-01
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