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2023年7月 第38卷 第7期11
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三维细胞培养在青光眼研究中的应用

Application of three-dimensional culture in the study of glaucoma

来源期刊： 眼科学报 | 2024年8月 第39卷 第8期： 409-415 发布时间：2024-08-28 收稿时间：2024/10/18 10:41:24 阅读量：274
作者：
蒋宇凡,
车煜彤,
杨扬帆,
关键词：
青光眼三维培养小梁网视网膜三维支架
glaucoma three-dimensional culture trabecular net retina three-dimensional support
DOI：
10.12419/24073102
收稿时间：
2024-07-15 
修订日期：
2024-08-03 
接收日期：
2024-08-26 
青光眼是全球首位不可逆性致盲性眼病，其特征是视网膜神经节细胞(retina ganglion cells, RGCs)的退行性改变，对全球经济和健康造成了重大影响。其病理变化的分子及生物机制尚不明确，目前青光眼手术和药物治疗仍然局限于将眼压控制在正常范围。小梁网作为房水排出的重要途径，是眼压控制的关键一环。眼压改变引起的视网膜退行性改变是青光眼重要病理过程之一。小梁网及视网膜的体外模型构建是研究青光眼发生发展的主要研究方法。三维培养技术可以使细胞在体外形成一定的空间结构，有利于细胞-细胞及细胞-环境的相互作用，相比传统二维培养，三维培养更加接近体内细胞的生理环境，对于研究疾病的病理生理变化及高通量药物筛选具有重要意义，同时，三维培养更有利于对细胞空间构象变化及其力学性质改变进行研究。三维打印等新技术也在三维细胞培养中有所应用，为三维定制化培养提供技术基础。文章综述了小梁网及视网膜细胞三维培养在青光眼基础研究中的应用研究进展，旨在为进一步探究青光眼病理生理机制提供新的思路。
Glaucoma is the world's first irreversible blinding eye disease, characterized by degenerative changes in retinal ganglion cells (RGCs), which have a significant impact on the global economy and health. The molecular and biological mechanisms of its pathological changes are still unclear. At present, glaucoma surgery and drug therapy are still limited to controlling the intraocular pressure in the normal range. Three-dimensional culture technology can enable cells to form a certain spatial structure in vitro, which is conducive to cell-cell and cell-environment interactions. Compared with traditional two-dimensional culture, three-dimensional culture technology is closer to the physiological environment of cells in vivo, which is of great significance for the study of pathophysiological changes of diseases and high-throughput drug screening. This review discusses the application of trabecular mesh and three-dimensional culture of retinal cells in the basic research of glaucoma, aiming to provide new ideas for further exploring the pathophysiological mechanism of glaucoma.

文章亮点

1. 关键发现

 • 通过总结国内外小梁网与视网膜细胞三维培养技术与研究进展，探索青光眼体外研究新的研究靶点。

2. 已知与发现

 • 三维培养使得体外培养细胞更加接近体内生长形态。
 • 小梁网和视网膜三维培养在基础研究领域已取得一定成果。

3. 意义与改变

 • 小梁网和视网膜体外三维培养能够提供更多细胞生长信息，在疾病病理生理过程研究和药物研发等领域具有重要意义。

       青光眼是一组以视网膜神经节细胞(retina ganglion cells, RGCs)退行性改变及视野缺损为共同特征的疾病，会引起不可逆性视功能损伤[1-2]。全球约有9 500万人患有青光眼，造成了严重的经济及卫生损失[3]。青光眼分为开角型和闭角型青光眼，眼压升高是其共同的危险因素，也是目前手术和药物干预的主要目标[4-5]。目前研究认为，眼压升高是由于房水外排受阻，小梁网施莱姆管是房水外排的主要途径[6]。而小梁网的病理生理机制目前仍不明确，一部分原因是小梁网的空间结构变化是影响房水流出的重要因素，传统的二维体外细胞培养难以对这一机制进行深入研究，具有较大的局限性[7-9]。小梁网细胞的体外三维培养能够构建出具有一定空间构象的小梁组织，有利于观察小梁网在生理及干预条件下的立体结构变化，能进一步阐明小梁网房水外排途径的病理生理机制，从而为青光眼诊疗提供新的靶点。
       高眼压引起的RGCs损害是青光眼发病的又一重要病理过程[10-11]。现有的视网膜及视神经乳头变性模型尚存在一定局限，不能完整反映青光眼损伤过程。同时，青光眼引起的RGCs病变损失不可逆，但有临床前研究表明，在适当条件下进行早期RGCs细胞移植，可以在一定程度上恢复视网膜的完整性[12-13]。三维培养技术有利于进一步明确RGCs损伤的病理生理机制，阐明病理损伤出现的阶段，从而实现更有针对性的细胞治疗。
       本综述中，我们首先概述了三维培养的基本原理和方法，并介绍现有的小梁网细胞及RGCs三维培养进展及其在青光眼研究中的应用，旨在为青光眼诊疗提供新的方向。

1 体外三维细胞培养模型的原理及应用

       动物模型及体外细胞培养模型均被广泛用于基础研究以阐明疾病机制或用于药物开发，但动物模型的不一致性和二维细胞培养的过度简化不利于对疾病发病机制的研究。动物实验流程标准化程度低、环境条件差异及物种间差异性均影响着动物实验结果的应用。而二维细胞培养丧失了特定组织的结构及功能信息，其实验结果难以完整阐明病理生理机制[14-15]。进一步完善机制研究需要构建一个具有更高稳定性且能够提供更多结构功能信息的体外模型。三维培养通过微工程技术在三维系统中培养细胞，使其形成一定的空间结构，进而模拟细胞-细胞、细胞-环境的正确相互作用[16-18]。在三维培养中，细胞具备空间形态和极性，其基因表达、信号传导和代谢相比于二维培养细胞与体内原组织更为相近[19]。同时，三维培养也能提供更多有关组织生长分化及形态学方面的信息。

1.1 三维培养模型方法

       目前，三维培养模型主要包括无支架的三维培养模型和有支架的三维培养模型。无支架的三维培养模型又称之为三维多细胞聚集球体模型。通常是由细胞单独培养或者共培养技术来构建的模型，主要的方式包括使用超低附着培养板或采用悬挂滴培养、旋转培养和凹板法，以及采用近年来出现的微流芯片技术等[19-20]。有支架的三维细胞培养模型是将目标细胞、细胞生长因子、再造基质蛋白与支架混合后共同培养。体内细胞本身存在高度异质性，不同细胞与细胞微环境之间具有复杂的相互作用，因此与无支架的三维细胞培养模型相比，有支架的三维细胞培养模型通过更换不同的细胞支架，更有利于模拟体内细胞之间、细胞与基质间和组织间信号的传递[21]。支架起到类似细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的作用，其性质直接影响细胞的生长状态，因此必须支架选择上必须能够反映对应细胞ECM的特征[22-24]。目前使用的水凝胶支架分为天然水凝胶和合成水凝胶两类，其中天然水凝胶(例如 Matrigel、纤维蛋白凝胶和藻酸盐)生物相容性好、凝胶化过程温和，应用更为广泛[25-26]。

1.2 三维培养技术应用

       三维培养相比二维培养能够更好地模拟体内细胞的微环境，且相比于动物实验没有伦理的限制，能够进行更多实验干预，因此广泛应用于肿瘤、皮肤、肝病及皮肤等各种组织的机制研究及药物筛选等。三维培养可以使细胞产生与体内肿瘤细胞相似的极性与基因表达，有利于模拟体内细胞微环境，对于肿瘤病理机制研究、细胞异质性分析以及抗癌高通量药物筛选均有重大意义。近年来，肿瘤细胞三维培养发展迅速，能够针对疾病的特殊性，实现对不同肿瘤细胞的特异性三维培养，从而为实现个性化抗肿瘤治疗提供新的思路。徐怡朦等[27]通过水凝胶支架及三维生物打印技术构建了人乳腺癌细胞MCF-7和人乳腺癌细胞MDA-MB-231的三维细胞培养模型，并对比分析了在二维和三维细胞培养模型中阿霉素对癌细胞的增殖效果的影响，结果表明水凝胶三维培养细胞抗药性明显高于二维培养细胞，证明三维培养细胞能更好地评估抗癌药物的疗效，从而用于抗癌药物筛选。
       此外，肠道细胞的三维培养近年来进展迅速，体外培养的肠类器官可以很好地模拟体内肠隐窝和微绒毛等结构，在此模型中细胞可以吸收培养基中的氨基酸、葡萄糖、无机盐等营养成分，具有类似体内肠道的功能。梁提松等[28]使用水凝胶构建三维Caco-2细胞培养模型，对杨梅花色苷在体外吸收和抗氧化性进行了评价，验证了三维Caco-2细胞培养模型比二维细胞培养模型更具优势。

2 小梁网细胞三维培养及应用

2.1 小梁网生理形态及青光眼小梁网病理变化

       小梁网是由胶原纤维和弹性纤维构成的多孔网状结构，组织学上分为三层，分别为葡萄膜小梁网(uveal trabecular meshwork, UTM)、角巩膜小梁网(corneoscleral trabecular meshwork, CTM)及近小管组织(juxtacanalicular tissue, JCT)。葡萄膜小梁网和角巩膜小梁网为板层网状结构，负责吞噬和滤过房水内的可溶性色素。近小管组织是富含透明质酸和蛋白聚糖的结缔组织基质，其内部含有弹性纤维构成的弹性筛状丛，可能受眼压影响调节房水流出，是小梁网途径房水排出阻力的主要来源[29]。在青光眼发病前期，纤维蛋白原和微纤维相关蛋白形成纤维斑块沉积在JCT周围，出现内皮间质样转变，引起房水排出阻力增高[30]。转化生长因子-β (transforming growth factor-β, TGF-β )被认为是参与这种内皮间质样转变的最重要因素。在正常情况下，TGF-β 2活性会促进小梁网中的基质生成，以维持眼内稳态。原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)患者房水中TGF-β 水平升高，引起JCT内大量纤维斑块沉积，导致房水排出障碍[31]。
       与青光眼相关的特征性纤维化也可能是由小梁网细胞内氧化还原稳态的破坏所介导的[32]。过氧化物酶可维持细胞质内活性氧 (reactive oxygen species, ROS) 的水平，在衰老和青光眼小梁网细胞中表达量降低。这种变化会解除 ROS产生的抑制，进而增强TGF-β 和几种ECM基因的表达，包括α-平滑肌肌动蛋白(α -smooth muscle actin,α -SMA)和纤连蛋白[33]。高浓度的ROS还会导致DNA损伤，随后导致小梁网细胞丢失。最近的研究还表明，ECM 沉积与小梁网细胞功能障碍之间存在联系。内质网 (endoplasmic reticulum, ER) 参与ECM蛋白的合成和折叠，在青光眼患者中，ECM沉积速度过快会给内质网的合成机制带来压力，从而增加蛋白质错误折叠的发生率，这将激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)，以维持内质网的生物合成功能。然而，长期出现这种反应最终会导致内质网进一步功能障碍和小梁网细胞死亡[34-35]。

2.2 梁网三维培养的构建及在青光眼研究的应用

       小梁网的三维培养研究分为无支架三维培养和有支架三维培养两部分。无支架小梁三维培养，即三维球体小梁培养，通过悬滴法使小梁细胞在微重力环境下形成球体组织。这种培养方式大幅促进了细胞与细胞之间的相互作用，使其可能产生类似于真实组织的蛋白质网络。三维球体能够模拟真实组织的相关生物学特征。已有研究者使用人小梁网细胞进行球体三维培养，以研究其在青光眼发病机制中的作用。这些球体已被证实具有体内小梁网的特征，例如存在 ECM成分和细胞骨架蛋白。研究表明，三维培养的球体小梁网可以对机械应力做出应答，其生理反应与体内小梁网的生理反应一致。同时，这些球体被证实在结构和功能上与体内小梁网相似，并已用于研究各种药物对小梁网细胞的影响。在 TGF-β 2 或地塞米松刺激下，三维人小梁网球体明显变小且变硬。Watanabe等[36]成功构建了三维人小梁网球体，并发现 TGF-β 2引起三维球体显著缩小和僵硬，而这些影响被Rho激酶(Rho-associated kinase, ROCK )抑制剂显著抑制。作者团队使用含0.25%甲基纤维素培养基通过悬滴法构建三维培养球体小梁网，并利用TGF-β 2处理小梁网球体以模拟其纤维化改变。相比于对照组，TGF-β 2处理组小梁网球体体积明显缩小。同时，TGF-β 2处理后球体小梁网纤连蛋白、α-SMA等纤维化相关蛋白表达均明显增加，证实其存在纤维化改变。团队利用高内涵生物成像系统观察到小梁网细胞在球体内部呈现出网状空间排布，而在TGF-β 2处理后球体小梁网内部网状结构孔隙率和孔隙密度均有所下降。
       有支架的三维培养中常采用水凝胶作为支架构建三维培养模型。水凝胶支架作为小梁网细胞的载体，其机械性能会直接影响小梁网细胞的生理状态，水凝胶的孔径和形状极大地影响细胞的附着和迁移，以及水凝胶内部的营养和氧气运输，水凝胶的硬度则影响到小梁网细胞的形态及药物反应。 Osmond等[37]的一项研究通过单向冷冻和冻干技术合成了具有对齐多孔结构的胶原支架。为了更好地模拟体内结构，他们用硫酸软骨素 (chondroitin sulfate, CS) 处理胶原支架，以将糖胺聚糖残基连接到其表面。这些黏多糖在功能上有助于在小梁网界面产生过滤作用和流出阻力。通过原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)测量，胶原蛋白和胶原蛋白-CS 处理支架的机械强度与小梁结缔组织非常相似。此外，在初始细胞接种2周后，在胶原蛋白和胶原蛋白-CS 支架上培养的小梁网细胞中肌动蛋白的表达增加，而胶原蛋白-CS 表面培养的细胞的表达量略高。两种支架上也均观察到了小梁网细胞增殖和迁移，证明了该模型在模拟小梁流出通路的塑性特性方面的潜力。Waduthanthri等[38]开发了一种用于小梁网组织工程的可注射肽水凝胶，称为 MAX8。研究者发现，接种在固化的MAX8水凝胶上的小梁网细胞具有与体内观察到的形态、基因表达和迁移特性类似的特性。Waduthanthri[38]还使用 MAX8水凝胶建立了小梁流出的灌注模型，用地塞米松处理后，该模型小梁网流出阻力增强，且具有一定的时间相关性。Kleinman等[26]使用 Matrigel[一种由Engelbreth–Holm–Swarm (EHS) 小鼠肉瘤细胞分泌的基底膜基质]构建了三维小梁网模型。Matrigel被广泛用于组织工程培养，以模拟涉及癌症转移、血管生成、细胞迁移和分化的细胞-ECM 相互作用。与MAX8水凝胶中小梁网细胞均匀扩散不同的是，在 Matrigel中培养的原代小梁网细胞在11 d后聚集成簇。与其他三维培养方法相同，用地塞米松和 TGF-β2 处理 Matrigel模型会导致小梁网细胞形态、ECM表达和 F-肌动蛋白出现类似青光眼的改变。
       无支架三维细胞培养能够形成相对独立的细胞微球，后续通过高内涵显微镜或AFM可以对其体积、表面形貌及硬度等形态学指标进行检测，为小梁网纤维化表现提供更多信息。相比于无支架培养，有支架三维细胞培养通过更换不同材质的支架，能够更好地模拟小梁网细胞在体内的生长形态，更有利于细胞之间的物质传递和信息交流。
       除了使用水凝胶支架外，还可以使用三维打印机建立小梁网生理三维组织工程模型。生物打印是一种新兴技术，由于其打印速度快和形状控制佳而越来越受欢迎。与标准光刻方法相比，三维生物打印可以在更广泛的生物材料上产生更细微的结构图案。然而其分辨率还不足以模拟体内小梁网的10 μ m大小的孔隙。因此，建立小梁流出通道的三维生物打印模型进展非常有限。Huff 等[39]通过使用海藻酸钠和甲基丙烯酸酯明胶来优化这些模型的孔隙分辨率。与基于挤压的传统三维打印相比，立体光刻三维生物打印由于其分辨率更高且无需机械挤压，可能成为构建未来小梁网体外模型的新方法。四维打印在三维打印的基础上加入时间作为第四维，使得三维模型可以在对应的条件下产生预定的变化，能够构建可控的动态培养系统[40]，这对于小梁网体外模型的构建具有重要意义。

3 视网膜神经节细胞三维培养及应用

3.1 青光眼RGCs的病理生理变化

       RGCs作为视网膜最关键的细胞之一，负责视觉电生理信号的传导，RGCs死亡是青光眼致病过程的关键阶段，可能的机制包括氧化应激、兴奋毒性损伤、线粒体功能障碍、神经营养因子缺失、内在和外在凋亡信号的激活和反应性神经胶质增生等。由于RGCs死亡原因复杂，机制不清，需要建立更加完善的模型予以阐述。

3.2 视网膜神经节细胞三维培养的构建及在青光眼研究的应用

       与二维培养相比，三维培养的RGCs能够显著促进细胞-细胞、细胞-基质之间的相互作用，以更好地模拟体内环境。目前主流构建三维培养RGCs的方式是利用水凝胶支架材料。Hertz等[41]评估了直接在具有不同成分的水凝胶支架上共培养的 RGCs 和无长突细胞的存活率和形态。通过改变聚乙二醇和聚赖氨酸的比例和分子量，以及每种聚合物上胺与羟基残基的比例，可以改变水凝胶的机械强度和化学性质。在生产的各型水凝胶中，那些使用高分子量聚乙二醇且胺与羟基比率为3:1或4:1的水凝胶能够促进RGCs和无长突细胞的生长。Laughter等[42]开发了一种生物相容性可注射水凝胶，用于封装移植到人类青光眼患者视网膜中的RGCs移植物。这种复合水凝胶被称为 PSHU–PNIPAAm–RGD，由三种成分组成聚丝氨醇六亚甲基脲(Polyserinol hexamethylene urea, PSHU)，一种可修饰的支架，可模拟天然视网膜 ECM；甘氨酸–精氨酸–甘氨酸–天冬氨酸-丝氨酸 (Gly–Arg–Gly–Asp-Ser acid, GRGDS)，一种在 ECM 的许多成分中发现的整合素/细胞结合序列；聚N-异丙基丙烯酰胺(N-isopropylacrylamide, PNIPAAm)，一种热敏、水溶性均聚物。这种水凝胶可以在室温被注射，于37 ℃形成固态凝胶。相比于二维盖玻片上培养的RGCs，在PSHU-PNIPAAm-RGD水凝胶中培养的RGCs活性更好，而且呈现出“层状生长”的状态。
       3D 打印技术也被用于构建三维RGCs模型。Kador 等[43]开发了一种热喷墨3D打印平台，用于构建电纺丝纳米纤维支架。通过这种技术，研究者可以控制RGCs在三维培养中的分布以及轴突的方向。但当前的 3D 打印技术仍存在一些值得注意的问题。 例如，喷墨打印本质上会对打印细胞产生急性机械应力，这将不可避免地导致细胞损伤。尽管可以优化某些打印缓冲液以最大限度地减少此类应力对 RGCs 存活的影响，但这些混合物通常会严重影响细胞的附着和电生理。在生物墨水中加入海藻酸盐以增加交联缓冲液的黏度和钙含量只能部分解决这些损害。最后，由于生物打印材料的黏度和机械强度有限，它们无法支持多层结构。因此，打印技术尚不能重现复杂组织微环境的三维RGCs架构。因此，在 3D 打印技术可用于制备临床相关的视网膜模型之前，还需要诸多技术革新。

4 展望

       本综述总结了青光眼研究中有关三维小梁网及RGCs三维培养的方法及应用方面的内容。利用悬滴法、微流体、水凝胶支架及3D打印等技术，可以一定程度上在体外实现对体内小梁网及RGCs三维结构的模拟。相比于二维培养细胞，三维培养细胞的极性及基因表达更加接近体内的组织细胞，能够更好地研究疾病的发生过程或用于高通量药物的筛选。小梁网细胞作为房水外排的关键环节之一，其三维培养能够使细胞微环境更加接近体内房角组织，并反映青光眼中小梁网的形态学改变，对进一步阐明青光眼病理生理机制具有重大意义。RGCs的三维培养能够完整反映青光眼RGCs的病理改变及病变节段，为后续个性化的细胞治疗提供理论基础。3D支架打印技术为三维培养带来了新的活力，能够设计出符合特定需求的细胞支架，但在材料生物相容性、细胞损伤性等方面尚存在一定限制，还需要进一步的改良。综上所述，三维培养在青光眼的病理机制研究、药物筛选及个性化治疗方面均起到了举足轻重的作用，是青光眼研究的重要体外模型，其技术的革新有利于青光眼研究的深入发展。

利益冲突

所有作者均声明不存在利益冲突。

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1、高校基本科研业务费重点项目(23xkjc022)。
This work was supported by Fundamental Research Funds for the Central Universities, Sun Yat-sen University (23xkjc022).()
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一亿年进化出的晶状体有多重要？

How important is the lens evolved in 100 million years?

发布于: 2022-12-01
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