文章亮点

 1. 关键发现

• 眼部标本具有微量、多样及背景复杂的特性。针对此难点，本研究建立了适用于眼科的病原宏基因组测序（metagenomic next-generation sequencing, mNGS）检测体系，提出在湿实验环节不建议去人源处理，并建立本地化背景微生物库以提高检测准确性。

 2. 已知与发现

• mNGS通常仅用于病原检测。本研究发现，通过分析测序数据中保留的宿主核酸信息，可检测染色体拷贝数变异（copy number variation, CNV），从而提示眼内淋巴瘤等肿瘤风险，实现了 “一次检测，双重筛查（感染+肿瘤）”。

 3. 意义与改变

• 明确了mNGS在眼科不宜作为一线盲目筛查手段。文章总结的实验室全流程经验与多学科协作（multidisciplinary teams, MDT）模式，有助于推动该技术在眼部疑难感染诊疗中的规范化应用，降低解读误区。

        自新型冠状病毒感染疫情暴发以来，临床对快速、精准的病原学诊断需求日益迫切。分子诊断技术因其快速、特异性强等优势得到广泛应用，其中病原宏基因组高通量测序技术表现尤为突出。该技术在临床的迅速推广，充分体现了其显著的诊断价值。一项优良的检测技术从研发到临床稳定应用，需经历技术开发、试剂注册、方法推广、临床/实验室培训、样本测试、流程优化、结果验证以及设备试剂采购等多个环节。由此可见，新技术的顺利开展需要研发机构、临床实验室与临床医生三方协同合作，各司其职。目前该技术在湿实验环节存在宿主 (人源) 核酸干扰，污染控制困难的问题，缺乏标准化协议没有诊断阈值是众多数据库存在的问题，解释结果的复杂性是临床和实验室需要共同面对的问题。由于该技术对不同标本类型的处理高度个性化，正确应用，规范送检，结合临床解读是临床医生用好这项技术的前提。

        自2021年起，本实验室逐步建立了针对多种眼部标本的病原宏基因组测序检测体系，并积累了一定的实践经验。本文从眼科专科实验室角度，就该技术在眼科临床应用中的体会进行探讨。

1 技术概述

         传统的病原学诊断是临床医生根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对疑似诊断进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体^[1]，如检测疱疹病毒的荧光定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）方法，需要有特异性引物和探针才能有针对性进行检测，而像弓形虫等病原目前还没有临床能用的PCR检测试剂。宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）则不使用特定引物，可以检测任何有核酸的生物体^[2]能够同时对数十万至数百万条DNA分子进行测序分析。mNGS通过对样本中全部生物基因组进行测序，在感染性疾病诊断中侧重于微生物基因组的识别与分析^[3]。近年来，mNGS已广泛应用于各类感染性疾病的诊断，并针对不同部位及类型的样本形成了相应的标准化流程^[4-6]。眼部感染性疾病可累及全眼球结构，包括眼表结膜炎、角膜炎及眼内炎等，属于除血流感染、中枢神经系统感染和呼吸系统感染外的局灶性感染。对于疑似局灶性感染的患者，在完成常规生化、培养或PCR检测后若未获得病原学诊断结果，推荐将mNGS作为二线首选检测手段^[1]。因此，mNGS技术适用于眼部疑难复杂感染性疾病的病原诊断，且眼部标本具有鲜明的专科特点。

2 眼部标本类型

        眼科作为手术科室，标本类型多样。按大体类别可分为组织标本（如角膜）和液体标本（如房水、玻璃体、视网膜下液、眼表冲洗液等）；按部位可分为无菌部位标本和有常驻菌群部位标本。若进一步按具体取材部位及眼别细分，眼部标本类型可达数十种。不同部位的标本在核酸提取、建库及报告分析等环节需采取不同的技术策略，因此建议临床送检时清晰地标注标本部位、类型及眼别，以确保检测准确性，体现专科检测的专业性。实验室人员需掌握眼科手术、眼部解剖结构及常见疾病知识，以确保各类眼部标本的规范处理。

3 标本量与前处理策略

        眼部标本微量是公认的客观现实，也是限制多种检测方法应用的瓶颈。在mNGS检测中，房水标本（约100 μL，目测澄清者，除外前房积脓）是核酸含量最低的标本类型。目前多数技术方案在湿实验环节引入去人源处理，以提高病原体检出效率^[1]。然而，基于本实验室的经验，针对眼部标本不建议在湿实验环节进行去人源处理，原因如下：1）眼部标本微量，去人源步骤可能导致样本进一步损失；2）与血液、肺泡灌洗液等标本相比，眼部标本成分相对简单，更有利于病原体检出；3）人源序列比例可作为数据质控及病原真实性的辅助判断依据；4）保留人源数据可用于后续肿瘤相关分析。尽管未进行去人源处理，眼部标本仍存在因核酸量过低导致建库失败的风险。本实验室通过添加非生物源标签核酸序列以补充总核酸量，从而保障建库成功率。

        眼表冲洗液是疑难复杂性角结膜炎的理想mNGS检测标本。操作方法为使用1 mL一次性注射器（去除针头）或专用眼部采样器吸取100 μL无菌生理盐水滴入眼表，使其充分接触角膜及结膜囊，嘱患者轻眨眼后回吸收集液体（约50~80 μL）送检。需注意避免采集流出眼睑的液体，以减少皮肤菌群污染的影响。患者对该采样方式的接受度高，且较既往报道使用拭子对角膜结膜进行取材的方法降低了引入外源微生物背景的可能性^[7]。本实验室已通过该类型标本成功利用mNGS检测出真菌、细菌、病毒及寄生虫等多种病原体。相较于眼表伪膜、溃疡刮取物等高人源标本，眼表冲洗液人源背景较低，更有利于低载量病原体的检出。

4 眼部标本中的背景微生物

        mNGS技术能够无偏倚地检测样本中全部核酸序列，此为其核心优势，与此同时也带来微生物结果判读的挑战。样本中的背景微生物包括样本固有微生物（致病菌与共生菌）、试剂和耗材携带微生物以及环境微生物等，均会在mNGS结果中呈现。眼表角膜结膜部位有特定正常菌群定植，而眼内为无菌部位，房水、玻璃体属于无菌体液。根据本实验室的检测经验，常见眼部背景微生物见表1。

        表中所列微生物即为常见背景菌/正常菌，也可以成为责任病原即致病菌，检出结果需要充分结合临床和其他检查结果综合评价，mNGS结果不能作为实验室诊断金标准。除表中所列微生物外，试剂、耗材及实验环境中的背景微生物需由实验室根据本地检测数据进行分析。对于低序列数检出、致病性较弱且非眼部常见的微生物，应优先评估其可能来源。例如检出口腔来源微生物时，可能提示临床排查口腔相关问题。鉴于眼部标本核酸总量低，病原序列数常低于背景微生物序列数，建立稳定的背景库是确保低起始量标本准确检出的关键条件之一。随着qPCR技术在眼局部标本检测的应用，明确很多眼部疾病和病毒感染相关。qPCR是病毒检测的主流方法，由于临床可用的qPCR试剂种类有限，眼部病毒检出种类也相应受限，很多临床高度怀疑病毒感染的患者，qPCR检测阴性。mNGS作为分子检测的有益补充，对于眼部病毒种类能相对qPCR较为全面的检出。眼部常见的病毒为人疱疹病毒1型(HHV1/HSV-I)，人疱疹病毒2型（HHV2/HSV-II），人疱疹病毒3型（HHV3/VZV），人疱疹病毒4型（HHV4/EBV），和人疱疹病毒5型（HHV5/CMV），在mNGS检测中， 越来越多的病毒种类在眼部标本中被检出，有些病毒还没有证据证明会引起严重症状。随着HHV6和HHV7引起重症脑炎的病例陆续出现^[8][9]，提示眼科医生对眼部检出病毒种类应保持警惕。

5 报告解读

        mNGS报告中的reads数或相对丰度，本质上是一种相对定量指标，其反映的是特定病原体在当次测序数据总量中的占比，而非其绝对载量。这一特性构成了mNGS在定量解读上的核心局限：当样本间宿主背景核酸含量差异显著时（例如高宿主背景的组织样本与低宿主背景的房水样本），即使病原体的绝对拷贝数相同，其检测到的reads数和相对丰度也可能存在数量级差异。因此，reads数高并不必然意味着绝对载量更高。这与荧光定量PCR（qPCR）的原理有根本区别。qPCR通过靶标特异性扩增与标准曲线，将Ct值直接转换为绝对拷贝数，从而实现绝对定量。而mNGS的原始数据仅为相对定量，必须借助额外的校准技术，例如前面提到的加入可控浓度的非生物源标签作为内参，通过计算病原体与内参序列的比值，才能将相对丰度换算为近似绝对定量的估值。由于定量能力不足，mNGS技术临床应用存在一定受限，也有实验室在设计多种类内参，来实现mNGS定量可能，这与我们的设计思路不谋而合。

        随着检测技术的不断发展，许多检测项目已并非实验室可独立完成报告解读。mNGS技术尤其需要临床与实验室共同参与结果分析。实验室需了解样本信息、其他检查结果、临床病史及疑似病原体；临床医生则需提供详细的病史、接触史、初步诊断与倾向性意见。以眼部外伤后感染为例，致伤原因（如植物外伤、污水或泥土入眼）对病原体判断至关重要；内源性眼内炎需排查全身感染灶。近期本实验室检出的多例眼表微孢子虫感染病例中，多数患者有与鹦鹉接触史^[10]。通过科室查房与病例交流，临床医生在问诊中已增加宠物接触史查询，显著提升了一线诊断的准确性。此外，mNGS报告解读还需要生物信息学专家参与，审核序列比对质量，及时更新病原数据库，尤其对于罕见或低序列数病原。因此，mNGS报告解读实为多学科协作的过程。没有一项检测技术是完美的，尽管mNGS技术优势突出，也仍有其局限性。mNGS结果不能作为诊断金标准，尤其出现检出结果与临床症状不相符时，结合病史不能做出合理解释时，应使用传统方法进行验证，检出结核/非结核分枝杆菌时可选择抗酸染色、qPCR方法进行验证^[11]，检出隐球菌时可选用隐球菌抗原（CrAg）检测验证^[12]，而不能只根据mNGS结果进行治疗。

6 人源信息分析在肿瘤提示中的应用

        玻璃体混浊是眼科的常见临床表现，其病因需排除感染与眼内肿瘤（如眼内淋巴瘤）。传统检测方法难以通过单次检测同时满足感染与肿瘤的鉴别需求[13]。诊断性玻璃体切割术标本量有限且细胞数不确定，进一步增加了实验室诊断的难度。基于眼科临床对早期精准鉴别诊断的迫切需求，本实验室利用保留人源核酸的mNGS前处理流程，在生物信息分析中同步分析病原微生物与人源染色体信息，通过检测染色体拷贝数变异以提示肿瘤细胞存在（图1），从而实现感染与肿瘤的早期鉴别。该策略已在脑脊液、肺泡灌洗液及肺活检组织等标本中得到验证^[13-15]，也在眼部标本中成功检出多例EB病毒阳性且人源染色体显著突变经证实为弥漫大B淋巴瘤病例^[16]，展现出良好的眼科应用前景。目前该技术仅能提示染色体水平异常，尚不能区分肿瘤具体类型。我们计划在此基础上尝试进行已知肿瘤基因检测，以期待能够进一步明确肿瘤种类，为临床诊疗提供更精准的依据。

图1 正常人体细胞染色体与眼内肿瘤细胞突变染色体对比示意图

 Figure 1 Schematic diagram comparing normal human cell chromosomes and mutated chromosomes in intraocular tumor cells.

上：正常人体细胞染色体。

下：眼内肿瘤细胞突变染色体。

Top: Chromosomes of normal human body cells.

Bottom: Mutated chromosomes of tumor cells in the eye.

7 总结

        病原宏基因组测序技术是感染性疾病病原检测方法的必要补充。近年来该技术多次在各种疑难复杂感染性病例中使用。如在诊断结核分枝杆菌和真菌感染的下呼吸道疾病方面表现出卓越的时效性和特异性^[16]。在结核/非结核分枝杆菌感染诊断数据中，只有62%通过细菌学确诊，而mNGS的灵敏度为92.31%，凸显了传统技术向分子诊断的迫切需求^[17]。

        病原宏基因组测序技术适用于眼科疑难复杂感染性疾病的病原诊断，对于引起内源性眼内炎的肺炎克雷伯菌检出率可达97.6%^[18]。由于其操作复杂，成本较高，结果分析影响因素多，不推荐作为常规一线检测方法。眼部标本具有鲜明的专科特点，mNGS属于高度复杂的检测项目，应严格掌握其适用指征。参考中枢神经系统感染的适用范围^[1]，建议眼科在以下情况中应用mNGS检测技术（图2）

图2 mNGS眼科临床应用决策流程 

Figure 2 Decision tree for clinical application of mNGS in ocular diseases

        针对眼部标本，湿实验环节不建议进行去人源处理；样本采集、运输及保存应规范，以控制外源污染与微生物增殖；检测全过程需实施全面质控；报告应明确病原体检出情况，而非仅提供原始数据；实验室职责为确认样本中是否存在病原体，临床职责则需结合临床表现判断其致病性。病原宏基因组测序技术是对现有病原诊断方法的重要补充，在急危重症及复杂感染中具有显著优势。眼部感染多以局部病变为主，因此局部标本检测尤为重要。规范并完善该技术在眼科的应用具有重要意义。

8 展望

        医学技术的进步为复杂疾病提供了更快速、更精准的诊断手段。病原学诊断始终是感染性疾病诊疗的核心。宏基因组高通量测序技术通过无偏倚检测临床样本中的微生物与宿主核酸，在感染病原诊断中应用广泛。尽管眼部标本微量，通过建立符合其特点的检测方法，规范取材，增加人源染色体分析流程，可为眼部疾病患者提供更多诊疗机会。“一症多病、一病多症”是临床常见的挑战。现代眼科兼具手术与内科诊疗需求，既追求手术精准，也强调感染等疾病的综合管理。因此，眼科医生需了解适用于眼部疾病的检测方法，合理选择检测项目；眼科实验室则应立足临床需求，优化技术流程，开展具有临床价值的检测项目。同时，我们期待更多企业关注眼科领域，研发适用于眼部微量标本的新技术与新产品。认知常滞后于技术发展，随着眼部标本检测技术的不断进步，诸多疑难眼部疾病的病因将得以明确。眼部疾病的精准诊疗始于眼部标本的精准检测，前路仍长。愿眼科临床与检验实验室携手同行，在探索眼部疾病精准诊断的道路上逐光前行。

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