七、统计学方法

       烧伤后 6 h, 烧伤边缘残存上皮细胞变扁平,呈单层向烧伤区移行。烧伤后 1 d, 近烧伤边缘区已有约 1 / 4 烧伤区为单层扁平上皮细胞覆盖, 烧伤区周围角膜基质水肿, 有中性粒细胞及巨噬细胞浸润。在烧伤后 6 h 和 1 d, 两组 HE 表现基本相同。至烧伤后 3 d, 实验组约有 1 / 2 烧伤区为新生上皮覆盖, 近边缘新生上皮层数增加到 2～3 层, 近烧伤区中央新生上皮仍为单层, 角膜缘基质层中可见大量炎性细胞浸润, 基质增厚; 而对照组新生上皮覆盖区<1 / 2 烧伤区, 单层新生上皮间连接较实验组疏松。烧伤后 7 d, 两组角膜上皮细胞基本覆盖烧伤区, 近边缘区新生上皮由表层的 2 ～3 层扁平细胞和下层的单层立方细胞组成, 烧伤区中心上皮细胞为 2 ～3 层扁平细胞, 但对照组新生上皮层与下方基质间有较多空泡, 连接似不够紧密, 上皮下基质水肿、结构疏松, 炎性细胞浸润明显。烧伤后 14 d, 实验组与对照组角膜上皮缺损均已修复,新生上皮为 4 ～5 层, 由 1 ～2 层立方上皮细胞和 2～3 扁平细胞组成, 与实验组相比, 对照组新生上皮细胞浅层中可见大小不等较多空泡状结构, 使部分区域的表层扁平细胞和基底层立方上皮细胞分离,而实验组基质中可见成群聚集的中性粒细胞及大量成纤维细胞, 烧伤区基质增厚明显(图 2) 。

       上皮空泡总面积结果为: 烧伤后 7 d 空泡总面积均值对照组为 19827.97 μ m² , 最大单个空泡面积达 6142.26 μ m² ; 实验组为 10910.38 μ m² , 最大单个空泡面积为 1157.73 μ m² 。烧伤后 14 d 空泡总面积均值对照组为 61633.55 μ m² , 最大单个空泡面积为 11332.10 μ m² ; 实验组为38878.54 μ m² ,最大单个空泡面积为 9155.79 μ m² 。不同时间点实验组与对照组空泡总面积经两独立样本t 检验,均显示有统计学差异(P < 0.01) 。

讨论

       本实验中观察到, 在兔正常角膜整合素 β1 仅在基底上皮细胞的基底侧细胞膜少量表达, 碱烧伤后 6 h, 邻近上皮细胞即已开始表达增加, 说明在创伤愈合早期, 整合素就已参与了损伤的修复;而且随上皮修复过程的进展, 整合素 β1 的表达进行性增加, 以利于新生上皮细胞的迁移、上皮与其下基质的粘附, 均与文献报道一致。

       本实验中也观察到, 在角膜碱烧伤愈合的整个过程中, 外源性 TGF-β1 的使用对角膜上皮愈合并无明显抑制, 反而在愈合中期(7 d～14 d) 减少了上皮的再次脱落而利于上皮愈合。这与部分文献报道有出入, 原因可能为与体外细胞培养或器官培养模型不同, 活体角膜碱烧伤模型中, 机体的炎症反应和损伤修复机制的启动, 内源性细胞因子的大量分泌, 使 TGF-β1 抑制上皮细胞增殖的作用不再成为主导因素, 而其促进上皮细胞移行的作用凸现出来。角膜上皮损伤早期主要是损伤周围上皮移行覆盖创面, 后期角膜缘干细胞增殖促进再生上皮复层化^[13] , 本实验中外源性 TGF-β1 的短期使用, 对后期细胞增殖的抑制作用较弱, 可能也是原因之一。

       在对照组烧伤后 7 d 和 14 d 时, HE 染色观察到新生的复层上皮细胞间、细胞与基质间中出现较多空泡、局部连接疏松, 而外源性 TGF-β1 实验组相同时间点 HE 染色观察新生的复层上皮细胞间、细胞与基质间中空泡较少、细胞排列较整齐,连接相对紧密, 同一时间点实验组空泡总面积明显小于对照组; 而同时, 实验组角膜上皮整合素β1 的表达在烧伤后 7 d 和 14 d 明显高于对照组。这说明新生的角膜上皮细胞要形成良好的复层结构, 与上皮下基质牢固粘附而避免再次脱落及上皮细胞整合素 β1 的表达成正相关。同时实验组的结果也表明外源性 TGF-β1 的短期使用可以增加新生上皮细胞整合素 β1 的表达, 提高角膜上皮的粘附能力, 促进角膜上皮愈合, 与体外实验研究结果相符。而 TGF-β1 增加上皮细胞整合素 β1 的表达的机制目前尚不清楚, 可能与二者存在共同的细胞信号转导途径, 如 p38MAPK 途径^[14] , 通过丝苏氨酸蛋白激酶活性的改变影响被调控基因的转录活性使整合素 β1 基因的表达增强有关。至于外源性 TGF-β1 滴眼液是否真正能够应用于角膜碱烧伤的治疗, 治疗时机的选择, 用药浓度和时间长短的确定, 还需要很多后续实验的支持。