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2023年7月 第38卷 第7期11
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形觉剥夺性和光学离焦性近视豚鼠视紫红质表达变化研究

Expression of Rhodopsin for Experimental Myopia of Form-depriVation and Defocus in Guinea Pig

来源期刊： 眼科学报 | 2008年3月 第24卷 第1期： 1-5 发布时间： 收稿时间：2024/11/8 15:53:04 阅读量：370
作者：
胡敏,
钟华,
刘永松,
刘睿,
陈冲达,
褚仁远,
关键词：
实验性近视眼视紫红质表达形觉剥夺光学离焦
Experimental myopia Rhodopsin expression Form deprivation Defocus
DOI：
收稿时间：
 
修订日期：
 
接收日期：
 
目的:研究形觉剥夺性和光学离焦性近视豚鼠视紫红质的表达变化,探讨视紫红质表达与实验性近视眼之间的关系。
方法:40只出生后1周的豚鼠随机分为形觉剥夺组和光学离焦组(n=20)，形觉剥夺组单眼戴半透明(半透明薄膜贴于平镜表面)平光硬性角膜接触镜片(Rigidgass-pemmeable contactlens, RCP)，光学离焦组单眼藏-4.0DRGP镜片，另一只眼为对照组。戴镜干预后1、2周各组分别测量屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度，并于上午10~12 点钟取材，实时荧光定量PCR观察视紫红质 mRNA 的变化 Westem-blot 观察视紫红质的变化，进行对比比较,统计分析。
结果:实验干预后1周，形觉剥夺组和光学离焦组与对照组相比各项指标无显著性差(除形觉剥夺组屈光度以外)。实验干预后2周，与对照组相比较，形觉剥夺组和光学离焦组明显发生近视、眼轴延长、玻璃体腔加深(t=22.20、18.32、19.65、15.78、6.18、11.20.P<0.01)：形觉剥夺组视紫红质及其 mRNA 表达均增加(t=17,489、14.31.P<0.05)光学离焦组视紫红质及其mRNA表达无明显变化。
结论:视紫红质的表达可能参与了形觉剥夺性近视眼的形成,而在光学离焦性近视眼中作用有限。

Purpose:To investigate the rhodopsin expression in form-deprived and defocus myopiain guinea pig and study the relationship between the rhodopsin expression andexperimental myopia.
Methods:Fourty guinea pigs were randomized into the form-deprived group and thedefocus group (n= 20 ). Guinea pigs in the form-deprived group wore a diffuser(rigidgass-permeable contact lens(RGP)on one eye since one week after birth. Those in defocus group wore a -4 D RGPon one eye. The contralateral eyes were left ascontrol. Refraction, axial length and depth of vitreous cavity were measured after 1and 2 weeks respectively. Retina were dissected at 10 ~ 12 o'clock in the moring.The level of rhodopsin and its mRNA were observed through Western-blot and real-time PCR respectively.
Result:There is no difference between form-deprived group, defocus group and controlgroups(except refraction in form-deprived group). One week later, there is nodifference between the form-deprived group, the defocus group and the control groups(except refraction in form-deprived group). Two weeks later, eyes in the form-deprivedgroup and the defocus group became myopic. Its axial length lengthened and depth ofvitreous cavity appeared deep. The form-deprived groups showed an increasedexpression of rhodopsin and its mRNA compared to the control groups. There is nodifference between the defocus group and the control groups.
Conclusion : Expression of rhodopsin might involve formation of form-deprived myopia,but has less influence on defocus myopia.

       近年来，近视眼发病机制的的研究取得了重大进展，确立了两种实验性近视眼的模型：(1)形觉剥夺性近视(Form deprivation myopia,FDM)指用缝合眼睑或戴弥散镜片严重破坏动物的光觉所引起的近视[1]。(2)光学离焦性近视(Defocus.induced myopia，DIM)，指强迫动物视近或戴负镜片使物体聚焦于视网膜后方，干扰动物的形觉，从而造成近视[2]。两种近视眼动物模型都说明屈光状态的发育依赖视觉，只有干扰正常的视觉环境才能引起近视[3]。视觉系统中首先感知视觉环境变化的部位是光感受器,随着视觉环境的改变,视杆细胞接受的光谱信号的组成和强度也会发生改变,视紫红质的表达可能会出现相应的变化。这种变化与近视眼的形成是否有关系目前国内外尚无相关研究。因此,我们通过对豚鼠形觉剥夺性和光学离焦性近视眼视紫红质的表达的变化进行研究，探讨视紫红质的表达在近视形成中的作用及可能的机制。

材料与方法

一、材料

       1.实验对象：选用1周龄体重为100 g左右的幼年健康三色豚鼠，实验动物由昆明医学院动物中心提供。
       2.硬性角膜接触镜片(Rigid gass-permeable contact lens, RGP):屈光度为0 D和-4 D；直径12mm；光学区 10.5~11.5 mm；后表面半径8 mm。由日本大和眼镜公司提供。

二、方法

       1.随机分组：光学离焦组：豚鼠出生一周后随机单眼戴-4 D RGP镜片(n=20)；另一只眼为对照组。形觉剥夺组：豚鼠出生一周后随机单眼戴半透明(半透明薄膜贴于平镜表面)RGP镜片(n=20)；另一只眼为对照组。
       2.RGP镜片的配戴清洗：将RGP镜片边缘用胶布包裹缠绕使之固定于胶布环中，新生豚鼠麻醉后，剪除眼眶周围的体毛，然后把包绕RCP镜片的胶布环用树脂粘胶粘贴于眼眶皮肤上，沿胶布环边缘用5-0丝线缝合一周，上下方留出两个缝隙，以免镜片染上水蒸汽，影响实验结果。每天通过预留的缝隙用棉签清洗镜片。
       3.眼球生物测量：(1)屈光度测定：实验干预1周、2周后复方托品酰胺滴眼液滴眼3次(间隔10 min)，麻痹睫状肌后，用带状检影仪进行双眼验光，两个熟练的验光师每只眼验光3次(计算球镜等效值(球镜+1/2柱镜)，精确到0.5 D)取平均值。(2)眼球参数的测定：实验干预1周、2周后表麻下动物A超仪(无锡康宁公司KN-2100)测定：玻璃体腔深度:Ⅱ眼轴长度。两个熟练的技师以自动模式连续测10次取平均值，精确到0.01 mm。
       4.取材：形觉剥夺、光学离焦组豚鼠实验干预1周、2周后各组随机选择3只，于上午 10~12 点钟之间采用腹腔内注射过量的戊巴比妥钠(0.2 mg/ml)的方法处死豚鼠，迅速摘取眼球，用显微剪沿角巩膜缘剪开，去除角膜、晶状体、玻璃体及锯齿缘，取出视网膜组织，所有样本放在-80℃冰箱保存。
       5.实时荧光定量PCR(Real-TimePCR)：(1)Trizol法提取细胞总RNA沉淀，FeroTec GradienPCR 基因扩增仪进行逆转录构建cDNA模板。参照NCBIGeneBank中的基因序列设计引物和TaqMan探针:目的基因：modopsin(上游引物:5'TCAACCCGCACGTCAACAAC3'，下游引物:5'GGAAGCCAGCAGATCAGGAA3'，扩增片段长度：220 bp)；管家基因 β-actin(上游引物：5'CCTCTATGCCAACACACTGC3'，下游引物：5'CTACTCCTGCTTCCTGATCC3'，扩增片段长度：211bp)。(2)用假定初始拷贝数(X)的cDNA模板按10倍梯度进行稀释，制成标准模板系列，建立标准曲线。Rotor-Cene 3000实时荧光定量PCR仪扩增，系统采集每一循环反应时的各反应管的荧光强度增长指数(DRn)并绘制扩增动力学曲线。根据动力学曲线确定每个反应管中荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数(C值)，再根据Ct值与标准模板的稀释浓度的初始拷贝数的对数值作图，得到该样本的标准曲线。(3)将逆转录得到的cDNA样本各取1L，在相同反应条件下进行PCR 扩增及检测荧光强度，自动绘制动力学曲线，判读其C值。采用比较阈值法计算待测样本中目的基因表达相对于校正样本的变化倍数。PCR反应过程中，无cDNA样品的空白管设为阴性对照。
       6.免疫印迹蛋白定量(Westem-blot)：细胞裂解液裂解视网膜组织，提取细胞的总蛋白质，以30 μg 蛋白质样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PACE)电泳，电转膜方法将电泳产物转至硝酸纤维膜上，5%BSA封闭，加一抗(免抗鼠S-opsin、L-opsin，浓度为1 : 3000)4℃过夜，TBS/T 洗膜3次，每次5 min。加人 HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1 h。TBS/T洗膜3次，每次5 min。扫描仪扫描显色带，用Image分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。检测重复3次。
       7.盲法处理：本实验采用单盲法设计，以上所有检查人员均不知实验动物的具体分组和干预措施。
       8.统计学处理：凡对照眼与实验眼间差异行配对t 检验，组间差异行方差检验或校正t 检验。取P≤0.05为有统计学意义，采用SPSS11.0forWindows 行双侧检验。

结果

       1.形觉剥夺性动物模型的建立：实验千预后1周，形觉剥夺组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的平均值分别为(-1.5+1.10) D、(8.09+0.13) mm、(3.66+0.06) mm。对照组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的平均值分别为(1.8±1.26) D、(8.02±0.12) mm、(3.59+0.05) mm。形觉剥夺组与对照组屈光度的差别有显著意义(P<0.05)，眼轴长度、玻璃体腔深度的差别无显著意义(P>0.05)。实验干预后2周，形觉剥夺组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的平均值分别为(-4+0.87) D、(8.28±0.09) mm、(3.92+0.04) mm。对照组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的平均值分别为(1.6+1.16) D、(8.06+0.08) mm、(3.64+0.04) mm。形觉剥夺组与对照组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的差别有显著意义(P<0.01；图 1)。
图1 形觉剥夺组与对照组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度比较
         2.光学离焦性动物模型的建立：实验干预后1周，光学离焦组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的平均值分别为(1.82+1.6) D、(7.89+0.13) mm、(3.63+0.04) mm。对照组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的平均值分别为(3.42+1.6) D、7.86+0.10) mm、(3.57+0.05) mm。光学离焦组与对照组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的差别无显著意义(P>0.05)。实验干预后2周，光学离焦组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的平均值分别为(-2±1.17) D、(8.05+0.11) mm、(3.75+0.04) mm。对照组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的平均值分别为(3.5+1.7) D、(7.92+0.09) mm、(3.64+0.04) mm。光学离焦组与对照组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度的差别有显著意义(P<0.01；图2)。
图2 光学离焦组与对照组屈光度、眼轴长度、玻璃体腔深度比较
       3.Real-time PCR结果：实验干预后1周，形觉剥夺及对照组视紫红质(modopsin)mRNA的内参校正值(rhodopsin/Beta-actin)分别为1.15±0.12、0.93+0.09；光学离焦组及对照组视紫红质mRNA的内参校正值分别为1.18+0.08、1.34+0.15:形觉剥夺、光学离焦组相对于对照组视紫红质 mRNA 表达均无明显增加(P>0.05)。实验干预后2周，形觉剥夺及对照组视紫红质mRNA的内参校正值分别为1.58+0.19、0.504+0.08:光学离焦组及对照组视紫红质 IRNA的内参校正值分别为2.22+0.12、1.53±0.55：形觉剥夺相对于对照组视紫红质 mRNA 表达增加，光学离焦组无明显区别(P<0.05;图3)。
图3 不同组别不同时间modopsin/Beta-actin mRNA 相对量罗:表示与对照组差别无显著性意义(P>0.05);*:表示与对照组差别有显著性意义(P>0.05)
       4.Westerm-blot结果：实验干预后1周，形觉剥夺及对照组视紫红质的内参校正值(rhodopsin/GAPDH)分别为0.715+0.03、0.703+0.05;光学离焦组及对照组视紫红质的内参校正值分别为 0.834+0.14、0.851+0.13；形觉剥夺、光学离焦组相对于对照组视紫红质表达均无明显增加(P>0.05)。实验干预后2周，形觉剥夺及对照组视紫红质的内参校正值分别为0.885+0.04、0.523+0.03；光学离焦组及对照组视紫红质的内参校正值分别为 0.728±0.12、0.728+0.18：形觉剥夺相对于对照组视紫红质表达增加、光学离焦组无明显变化(P<0.05：图4、5)。
图4 形觉剥夺、光学离焦及对照组2周视紫红质Westem-blot图像
EFD为形觉利夺组,FFD为形觉剥夺对照组，EPD为光学离焦组,FPD为光学离焦对照组
图5 不同组别不同时间odopsin/GAPDH 相对量
▲:表示与对照组差别无显著性意义(P>0.05);*:表示与对照组差别有显著性意义(P<0.05)

讨论

       本实验干预后1周时形觉剥夺组、光学离焦组与对照组无明显区别(除形觉剥夺组屈光度外)，到第2周就出现了明显近视，主要以眼轴延长、玻璃体腔加深为主。与其它研究相比干预时间较短[4,5]。可能是因为我们在豚鼠1周龄时即开始干预，而不是4周龄。另外有实验证明豚鼠“正视化”过程为35 d，豚鼠近视眼主要在此期间形成，且主要集中于干预后11 d内，与本实验结果相符。豚鼠形觉剥夺性近视的程度与时限界于鸡(-9 D, 5 d)与恒河猴(-5 D,17周)之间，豚鼠光学离焦性近视的程度与时限也基本一样。
       豚鼠形觉剥夺组视紫红质及其mRNA表达1周时与对照组相比无明显区别，2周时表达均明显增高，和形觉剥夺性近视眼的形成时间完全相吻合，豚鼠光学离焦组视紫红质及其mRNA表达与近视眼的形成之间无明显的联系。说明视紫红质的表达与豚鼠形觉剥夺性近视眼的形成有密切的联系，而与光学离焦性近视眼的关系不明显。形觉剥夺组半透明RCP降低了透光率，影响了豚鼠的光觉，暗光下视网膜视杆细胞活动加强，自然视紫红质表达增高。但第1周豚鼠形觉剥夺近视眼未形成时，同样是暗光环境，视紫红质表达并无明显变化，直到第2周近视眼形成时才出现表达增高。证明视紫红质表达上调不仅是暗光环境所引起的代偿变化，而且应该参人了豚鼠形觉剥夺性近视眼的形成。
       有研究发现晚上在昏暗光线下睡觉的婴幼儿近视眼发病率明显增高[9]。因为昏暗光线下视杆细胞的活动将更频繁，其发病机制可能与视紫红质表达变化有关系。视紫红质参人形觉剥夺性近视眼的形成可能是通过视黄酸(retinoic acid, RA)来实现的，视黄酸作为维生素A的代谢产物其前体物质视黄醛构成视色基团的光敏感成分，视紫红质的再合成过程中可能会引起视黄酸的变化。而视黄酸可激活一大家族的转录因子，具有既与光线，图像加工，光传导有关，又与很多转录因子包括近视眼相关因素如胶原，细胞外基质等基因的转录调节有关的特性。与其他视网膜上只反映成像质量下降的生物活性物质(如多巴胺、血管活性肠肽、乙酰胆碱)不同，正负球面镜对于视黄醛含量的影响是不同的[11]，视网膜视黄醛可以作为眼球增长方向的信号[12]。
       当然，豚鼠形觉剥夺性近视眼视紫红质表达变化也可能是视网膜对外界视觉环境变化的一种适应性反应，同光学离焦性近视眼一样，与近视眼的形成没有直接的联系。视紫红质表达变化究竟是近视发生的原因，还是其伴随改变，目前仍不确定，下一步研究可以通过应用视紫红质的拮抗剂或阻断剂，观察近视的发生和发展是否被阻断或减轻，进一步明确其在实验性近视眼发病机制中的作用。
1、Kruger PB, Mathews S, Katz M,et al. Accommodationwithout feedback suggestsdirectional signals specifyocular focus. Vision Res,1997;37(18):2511-2526Kruger PB, Mathews S, Katz M,et al. Accommodationwithout feedback suggestsdirectional signals specifyocular focus. Vision Res,1997;37(18):2511-2526
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1、国家自然科学基金重点项目(30530770),云南省教育厅项目(06y221c)()
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